Příprava biologických vzorků, jako jsou kosti, rostliny, svaly nebo sputum, pro analýzu DNA, RNA, proteinů nebo metabolitů může být náročná. Společnost RETSCH nabízí laboratorní mlýnky a drtiče, které rozmělňují a homogenizují pevné vzorky, ale jsou vhodné i pro rozrušování buněk. Mlýnky RETSCH se používají v oblastech, jako jsou biotechnologie, diagnostika, forenzní medicína, zemědělství a mikrobiologie.
K extrakci buněčných složek z bakterií, kvasinek, hub nebo mikrořas se často používá metoda rozrušení buněk, která se provádí buď chemicky, nebo mechanicky. Mechanické metody jsou vhodnější pro buňky s pevnými stěnami nebo v případě, že by chemické látky mohly ovlivnit extrakci, a proto je třeba se jim vyhnout. Běžnou a účinnou metodou je míchání kuliček, při němž se ke narušování buněk v suspenzi používají kuličky. Míchání kuliček lze provádět v malém nebo velkém měřítku a s použitím různých typů lahviček a zkumavek. Jedním ze způsobů je smíchat suspenzi s kuličkami a použít vírový mixér. Tento postup je však pomalý a nekonzistentní, zejména při velkém počtu vzorků nebo dlouhých dobách rozrušení. Lepším způsobem je použití oscilačních mlýnů RETSCH s adaptéry, které proces automatizují, takže je rychlý, efektivní a reprodukovatelný.
Oscilační mlýn MM 400 - narušení buněk kvasinek*
*Video ukazuje předchozí model s totožným funkčním principem.
Zvýšená reprodukovatelnost celkové koncentrace bílkovin po přerušení buněk, 7 min. v
MM 400, 12 min Vortex.
Chybové úsečky: % směrodatné odchylky
MM 400 zpracuje až 20 vzorků v 1,5 nebo 2 ml zkumavkách Eppendorf bez křížové kontaminace, což šetří čas obsluhy. Kromě toho je k dispozici adaptér, který pojme až osm 50 ml zkumavek Falcon. Optimální velikost kuliček pro rozrušení buněk se liší v závislosti na typu buněk; pro bakterie a kvasinky se doporučují skleněné kuličky v rozmezí 0,75 až 1,5 mm, zatímco pro houby a mikrořasy jsou vhodnější menší kuličky v rozmezí 0,1 až 0,5 mm.
Pro extrakci DNA nebo RNA jsou ideální menší zkumavky na jedno použití o objemu do 2 ml, zatímco pro zpracování proteinů nebo metabolitů jsou vhodné větší zkumavky, jako jsou 50ml zkumavky Falcon. Optimální parametry vyklepávání kuliček se liší podle typu buněk. K nalezení nejlepších výsledků může být třeba experimentovat. Obvykle je k úplnému rozrušení buněk zapotřebí 30 s (většina mikrořas) až 7 min (kvasinky obecně) šlehání kuliček.
Tím, že oscilační mlýn MM 500 vario pojme až padesát jednorázových lahviček o objemu 2 ml, účinně zvyšuje průchodnost vzorku.
Buňky Phaeodactylum tricornutum před (vlevo) a po rozrušení buněk (vpravo) pomocí oscilačního mlýnu MM 400 v kombinaci s adaptérem Falcon tube.
Teplota hraje zásadní roli zejména v aplikacích, kde se jedná o proteiny citlivé na teplotu. Jedním řešením je kryogenní mletí (viz příslušná část), druhým je chlazení buněčné suspenze. U MM 400 se ukázalo, že nárůst tepla ve 2 ml zkumavkách je mírný i při 30 Hz; jednoduchým způsobem je přerušit doby přerušení >1 min chlazením adaptéru s lahvičkami v ledové lázni po dobu jedné minuty. Tímto způsobem se teplota udrží pod 12-15 °C v závislosti na použité velikosti kuliček.
Zvýšení teploty během rozrušování buněk v přístroji MM 400 při 30 Hz nebo pomocí Vortexeru, chlazení na ledu po každé minutě rozrušování buněk.
Způsobem, jak kontrolovat vývoj teploty při rozdružování s pomocí kuliček, je použití Oscilačního mlýnu MM 500 control. Speciální adaptér pojme osmnáct 2 ml jednorázových lahviček na jednu dávku. Stroj je připojen k chladicímu zařízení s vodou chlazenou na 4 °C, které následně chladí adaptér držící ampulky. Tímto způsobem se udržuje teplota suspenze kolem 13 °C, ale bez nepříjemných fází ručního přerušování v ledové lázni. Zatímco MM 500 control neakceptuje jednorázový adaptér pro zkumavky Falcon, lze jej použít s nerezovými mlecími nádobkami o objemu 50, 80 nebo 125 ml (viz příklad vlevo: P. pastoris).
Pokud se mlýnek používá s kapalným dusíkem a zařízením CryoPad a je nastaven na teplotu 0 °C, lze teplotu buněčné suspenze ve 2 ml zkumavkách na jedno použití udržovat dokonce při teplotě 0 °C, aniž by došlo ke zmrazení suspenze, takže je stále možné účinné rozdružování pomocí kuliček.
Některé biologické vzorky, například sputum pacientů s cystickou fibrózou nebo vzorky tkání, jako jsou játra, plíce nebo nádory, je někdy obtížnější plně homogenizovat. Dvoumililitrové zkumavky na jedno použití jsou často příliš malé na to, aby se do nich vešel celý objem vzorku, takže je nutné vzorek po procesu homogenizace rozdělit a znovu spojit, což přidává další práci a čas do laboratorní rutiny.
Do větších rozmělňovacích nádobek vyrobených například z nerezové oceli se vejde celý objem vzorku, ale je třeba je po každém použití vyčistit. Adaptér pro oscilační mlýn MM 400 tento problém řeší tím, že umožňuje použití jednorázových zkumavek o objemu 5 x 5 ml, které mají větší kapacitu a nevyžadují čištění. V jedné dávce lze homogenizovat 10 vzorků současně. K homogenizaci vzorků tkání lze použít také 50 ml zkumavky Falcon. Zde lze zpracovat 8 vzorků na dávku během pouhých několika minut.
Vzorek jater před a po homogenizaci v MM 400
Některé biologické vzorky, jako jsou vláknité rostliny, tuhé žíly, nehty nebo některé živočišné či nádorové tkáně, se v pufrovacím systému obtížně homogenizují. Jsou buď příliš měkké, nebo příliš tvrdé, nebo příliš vláknité, než aby je bylo možné účinně rozmělnit v suspenzi. Lepší alternativou pro tyto vzorky je kryogenní mletí, které zahrnuje jejich zmrazení kapalným dusíkem před nebo během procesu mletí. Díky této technice jsou vzorky křehké a lze je snadno rozdrtit na homogenní prášek. Kryogenní mletí má také tu výhodu, že zachovává integritu např. proteinů nebo těkavých látek, které by se mohly při vyšších teplotách rozkládat nebo odpařovat. Kryogenní mletí navíc může rozbít nitrobuněčné organely některých organismů, např. kvasinek.
U vzorků, které jsou lepkavé, jako jsou bobule, je kryogenní mletí často jedinou možnou metodou, jak získat rovnoměrný vzorek. V tabulce jsou uvedeny některé příklady vzorků materiálů, které byly úspěšně zpracovány kryogenním mletím v mlýně oscilačním mlýně MM 400 nebo v mlýně CryoMill. Pro kryogenní mletí v mlýně MM 400 lze použít 2 ml ocelové zkumavky. Podobných účinků lze dosáhnout MM 500 control s mlecími nádobkami o objemu až 125 ml pro větší objemy vzorků. Zde se pro práci s kapalným dusíkem musí použít podložka CryoPad. Ve všech uvedených mlýncích jsou k dispozici také 2 ml nerezové zkumavky a příslušné adaptéry pro menší objemy vzorků.
2 ml zkumavky z nerezové oceli
| Vzorek | Příslušenství | Vstupní množství | Doba mletí | Rychlost | Maximální výstupní velikost zrna (d90)/ |
| E. coli bacteria |
|
2 x 10 ml zmrazených buněčných pelet | 2 min | 30 Hz | úplné narušení buněk |
| muscle tissue |
|
10 g | 4 min | 25 Hz | <150 µm |
| pine needles |
|
3 min | 30 Hz | Reprodukovatelná extrakce RNA 20 vzorků v jednom kroku | |
| berries |
|
2 g | 40 secs | 20 Hz | <200 µm |
| finger nails |
|
1 nehet na ampulku | 2 min | 25 Hz | <200 µm |
| rat gut |
|
1.8 g | 2 min | 30 Hz | <150 µm |
Kousky masa před a po kryogenním mletí
Lepkavé bobule
před a po kryogenním mletí
Borové jehličí
před a po kryogenním mletí
Agarosový gel pro separaci RNA z rozemletého borového jehličí, který vykazuje dobrou reprodukovatelnost a množství připravené RNA
Forenzní vzorky, jako jsou vlasy, kosti a zuby, jsou většinou křehké, a proto je obvykle není třeba před rozmělněním chladit. Pro dosažení požadované analytické jemnosti může být nutné vzorky předběžně rozdrtit v čelisťovém drtiči nebo střižném mlýně, aby se velikost částic snížila na méně než 10 mm pro další zpracování v kulovém mlýně. Střižné mlýny se používají k předběžnému drcení kostí, které mohou být čerstvé, a tudíž ne zcela suché, a mohou dokonce obsahovat zbytky masa.
Společnost RETSCH nabízí řadu střižných mlýnů pro primární zmenšování velikosti měkkých, středně tvrdých, pružných, houževnatých a vláknitých materiálů vzorků. Široká škála příslušenství umožňuje optimální přizpůsobení různým aplikacím. Mlýn SM 300 lze vybavit třemi různými rotory a spodními síty od 0,25 mm do 20 mm. Na rozdíl od čerstvých a tukových kostí lze suché kosti zmenšit na velikost menší než 0,25 mm v jednom nebo dvou krocích. Model SM 300 má variabilní otáčky od 100 do 3 000 ot/min. Rozmělňování kostí nebo zubů či chlupů se většinou provádí v kulových mlýnech s použitím mlecích koulí > 5 mm z oceli, oxidu zirkoničitého nebo karbidu wolframu.
Vzorek kosti před a po mletí ve střižném mlýně
Lidské vlasy před a po jemném mletí v oscilačním mlýně
Jednou z možných komplikací operací kloubních náhrad, jako jsou například lokty nebo kolena, je infekce okolní tkáně různými bakteriemi. Tyto infekce, nazývané protetické kloubní infekce (PJI), se mohou objevit kdykoli od několika dnů až po několik let po operaci. Jejich léčba je obtížná, protože je mohou způsobovat různé typy bakterií a ne vždy jsou odhaleny běžnými metodami. Proto je nutné izolovat bakterie ze vzorků tkání způsobem, který zachová jejich životaschopnost a umožní jejich identifikaci a kultivaci.
V tomto případě může pomoci jednoduchý postup, který provádí Oscilační mlýn MM 400 Vzorky se smíchají s 20 ml sterilní demineralizované vody a 5 ml skleněných kuliček o průměru 1 mm ve sterilizované ocelové nádobě. Lze použít jednorázové 30 ml lahvičky se širokým hrdlem. Až 8 lahviček se protřepává po dobu 3,5 min při frekvenci 30 Hz, aby se ze vzorků odstranily bakterie, aniž by se zničily. Bakterie lze poté snadno kultivovat na agarové plotně pro další analýzu. Tato metoda má vysokou míru detekce (A.-L. Roux et. al 2010) a lze ji použít na jakýkoli pevný vzorek infikované tkáně, i když obsahuje implantovaný materiál.
Oscilační mlýn MM 400
Kryogenní mlýn CryoMill
Oscilační mlýn MM 500 control
Oscilační mlýn MM 500 nano
Oscilační mlýn MM 500 vario
